研究人員開發(fā)了一種新的顯微鏡技術，可以從包括大腦在內的生物組織內約100微米深處獲得亞細胞結構的三維超分辨率圖像。 通過讓科學家更深入地觀察大腦，該方法可以幫助揭示隨著時間的推移、在學習過程中或由于疾病而在神經元中發(fā)生的微妙變化。
這種新方法是STED顯微鏡的延伸，這是一種突破性的技術，通過克服光學顯微鏡的傳統(tǒng)衍射限制，實現了納米級的分辨率。斯特凡·赫爾因開發(fā)這種超分辨率成像技術而獲得2014年諾貝爾化學獎。
在光學學會(OSA)的高影響力研究雜志《Optica》上，研究人員描述了他們如何使用他們的新STED顯微鏡，以超分辨率對活體小鼠大腦深處的樹突狀刺的三維結構進行成像。樹突棘是神經元樹枝上的微小突起，它接受來自鄰近神經元的突觸輸入，在神經元活動中起著至關重要的作用。
"我們的顯微鏡是世界上第一臺在活體動物體內深處實現3D STED超分辨率的儀器，"研究小組負責人、耶魯大學醫(yī)學院的Joerg Bewersdorf說。"Bewersdorf說："深層組織成像技術的這種進步將使研究人員能夠直接觀察到原生組織環(huán)境中的亞細胞結構和動態(tài)變化。"以這種方式研究細胞行為的能力對于全面了解生物醫(yī)學研究以及藥物開發(fā)的生物現象至關重要"。
研究人員使用他的3D-2PE-STED顯微鏡對一只活體小鼠的大腦進行成像。放大樹突的一部分可以看到單個脊柱的三維結構。資料來源：Joerg Bewersdorf，耶魯大學醫(yī)學院。
更深入的研究
傳統(tǒng)的STED顯微鏡最常被用來為培養(yǎng)的細胞標本成像。使用該技術對厚的組織或活體動物進行成像是一個很大的挑戰(zhàn)，特別是當STED的超分辨率優(yōu)勢被擴展到三維STED的第三維時。出現這種限制是因為厚而密集的組織阻礙了光線的深入和正確聚焦，從而損害了STED顯微鏡的超分辨率能力。
為了克服這一挑戰(zhàn)，研究人員將STED顯微鏡與雙光子激發(fā)(2PE)和自適應光學技術相結合。"論文第一作者Mary Grace M. Velasco說："2PE通過使用近紅外波長而不是可見光，能夠在組織的更深處成像。"紅外光不易受散射影響，因此能更好地穿透到組織深處"。
研究人員還在他們的系統(tǒng)中加入了自適應光學技術。"Velasco說："使用自適應光學技術可以糾正光線形狀的扭曲，即光學畸變，這些畸變在組織內和通過組織成像時出現。"在成像過程中，自適應元件以與標本中的組織完全相反的方式修改光波。因此，來自自適應元件的畸變抵消了來自組織的畸變，從而創(chuàng)造了理想的成像條件，使STED的超分辨率能力在所有三維空間得到恢復。
看清大腦中的變化
研究人員首先通過對蓋玻片上的培養(yǎng)細胞的特征結構進行成像來測試他們的3D-2PE-STED技術。與單獨使用2PE相比，3D-2PE-STED解決了體積小10倍以上的問題。他們還表明，他們的顯微鏡可以比傳統(tǒng)的雙光子顯微鏡更好地分辨小鼠皮膚細胞核中的DNA分布。
在這些測試之后，研究人員使用他們的3D-2PE-STED顯微鏡對一只活體小鼠的大腦進行成像。他們放大了樹突的一部分，并解決了單個刺的三維結構。兩天后，他們對同一區(qū)域進行了成像，結果顯示，在這段時間內脊柱結構確實發(fā)生了變化。研究人員沒有在他們的圖像中觀察到神經元結構的任何變化，也沒有在小鼠的行為中觀察到可能表明成像造成的損害，他們計劃對此進行進一步研究。
Velasco說："樹突棘非常小，如果沒有超分辨率，就很難看到它們的確切三維形狀，更不用說這種形狀隨著時間的推移而發(fā)生的任何變化。3D-2PE-STED現在提供了觀察這些變化的手段，而且不僅是在大腦的表層，而且是在更深的內部，在那里有更多有趣的連接發(fā)生。"
